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解析逆轉(zhuǎn)錄實驗中操作問題
點擊次數(shù):2444 更新時間:2022-08-01

 

       逆轉(zhuǎn)錄(reverse transcription)實驗作為是常見的分子生物學(xué)實驗之一,逆轉(zhuǎn)錄是以 RNA 為模板合成 DNA 的過程,即 RNA 指導(dǎo)下的 DNA 合成,逆轉(zhuǎn)錄實驗包括3大要素,分別是引物、逆轉(zhuǎn)錄酶和 RNA 模板。雖然看上去步驟簡單,但是逆轉(zhuǎn)錄實驗中實際操作時常出現(xiàn)問題如下:

1. 如何提高 RT-PCR 反應(yīng)的靈敏度與特異性?

① 確定模板 RNA 完整性好,無 DNA 污染。

RNA 模板中不應(yīng)含有擴增反應(yīng)抑制劑。

③ 使用適量的模板 RNA ,模板量太多會降低特異性,太少會導(dǎo)致擴增不出條帶或條帶太弱。

④ 若模板中有二級結(jié)構(gòu),可通過提高逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度來提高擴增效果。

 

2.  RNA 中含有逆轉(zhuǎn)錄抑制劑時,怎么處理?

逆轉(zhuǎn)錄抑制劑包括:SDS 、EDTA 、甘油、焦磷酸鈉、亞精胺和胍鹽等等??蓪⒁汛_定的高質(zhì)量 RNA 模板同樣品混合,同高質(zhì)量 RNA 模板比較產(chǎn)量以檢測 RNA 抑制劑;若高質(zhì)量模板 RNA 與樣品混合后產(chǎn)量降低,則說明樣品中存在逆轉(zhuǎn)錄抑制劑,可用70%v/v)乙醇對 RNA 沉淀進行清洗,以除去抑制劑。

 

3. 逆轉(zhuǎn)錄后的 qPCR 實驗 Ct 值偏大或者普通 PCR 產(chǎn)量低。

RNA 模板質(zhì)量差,需要重新制備 RNA 模板,可通過瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量。

② 逆轉(zhuǎn)錄后的 cDNA 中含有高濃度的模板 RNA 和逆轉(zhuǎn)錄試劑成分,可能會對后續(xù)的PCR 產(chǎn)生抑制作用,所以可以適當(dāng)梯度提高 cDNA 稀釋比例(通常來說可將 cDNA 原液稀釋5-10倍,其*佳模板加入量以擴增得到的 Ct 值在20-30個循環(huán)為好)。

③ 起始的 RNA 模板量低,需要減少稀釋倍數(shù)或增加 RNA 模板量。

④ 基因本身原因(復(fù)雜和長度),可以重新設(shè)計復(fù)雜基因的引物,避免復(fù)雜結(jié)構(gòu)。或者用三步法程序或延長兩步法程序的延伸時間。

⑤ 逆轉(zhuǎn)錄或者定量產(chǎn)品性能差,可以通過做平行不用品牌產(chǎn)品對比實驗,對比逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品性能。

 

4. 逆轉(zhuǎn)錄酶擴增效率評估,應(yīng)該關(guān)注哪些指標(biāo)?

建議: qPCR-ct 值,或者 PCR 產(chǎn)量

如果想比較逆轉(zhuǎn)錄性能,尤為直接的還是后續(xù)做 qPCR 或者 PCR 平行對比實驗,這種方法相對較為準(zhǔn)確。

不建議:cDNA 中間產(chǎn)物濃度測定 or 其他方法。

逆轉(zhuǎn)錄完成后是不建議測定產(chǎn)物濃度的,由于逆轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生 RNA-cDNA 雜交鏈,溶液中的 RNA 和部分 DNA 會對吸光值產(chǎn)生影響,所以測定出來的產(chǎn)物濃度并不準(zhǔn)確,即使利用同一批次 RNA 和不同品牌的試劑盒進行對比實驗,由于不同品牌之間的逆轉(zhuǎn)錄體系具有或多或少的差異,其體系中的各種離子等都能對吸光度產(chǎn)生影響,所以測定的結(jié)果也沒有可比性。

 

優(yōu)化及注意事項:

1 逆轉(zhuǎn)錄 PCR 時,提取 RNA 是關(guān)鍵,需分離高質(zhì)量 RNA(純度和完整性)。

2、 整個操作過程需使用去 RNA 酶的槍頭、EP 管等耗材。

3、 逆轉(zhuǎn)錄過程中要謹(jǐn)防 RNA 酶的污染,加入 RNA 酶抑制劑。

4 為了防止非特異性擴增,必須設(shè)陰性對照。

5、 逆轉(zhuǎn)錄實驗應(yīng)全程在冰上操作完成,操作過程應(yīng)避免 RNase 污染。

6、 提高逆轉(zhuǎn)錄預(yù)熱溫度(也可根據(jù)相應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行調(diào)整)。

7 減少基因組 DNA 污染,可使用去基因組的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。

 

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