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對目的蛋白進行檢測分析時，總蛋白的提取至關重要，如蛋白提取不好會導致后續(xù)試驗的不理想甚至失敗，如：信號極弱或無雜交信號、背景高、非特異性條帶多等.根據目標蛋白的類型和實驗應用種類來選擇合適的RIPA裂解液，才能程度地保證后續(xù)實驗的成功。 Co-IP/IP RIPA Lysis Buffer對細胞有一定的裂解能力，能獲得較多的胞漿蛋白，而對細胞核的裂解能力有限，不能裂解細胞核，因此獲得的總蛋白適用于IP或CO-IP實驗；而WB Super RIPA Lysis Buffer對動物組織和細胞的裂解能力強，它可以裂解細胞核和線粒體，并可提取到更多的膜蛋白，從而可獲得更多的總蛋白。因其強的裂解能力，使得大量的基因組DNA從細胞核中釋放出來，使蛋白變的十分粘稠，使用Benzonase核酸酶消化可有效解決。經RIPA裂解液獲得得蛋白可用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度；使用Bradford法測定由本裂解液裂解所得到樣品的蛋白濃度會稍有誤差。
1.可很好的釋放胞漿蛋白，部分釋放膜蛋白和核蛋白。 2.經Co-IP/IP RIPA Lysis Buffer，核蛋白與DNA還緊密 結合在一起，離心后會造成核蛋白的丟失。 3.對于膜蛋白，Co-IP/IP RIPA Lysis Buffer的破壞力 小，不能使膜蛋白與膜充分分離，故離心后造成膜蛋白 的丟失。 4.在提取蛋白過程中，基因組DNA釋放使得蛋白提取液 變的十分粘稠，影響蛋白電泳和雜交效果。		1.可以很好的裂解細胞膜及細胞核，從而更好的釋放胞漿蛋白、核蛋白和膜蛋白。 2.對于核蛋白，經WB Super RIPA Lysis Buffer裂解后，核蛋白與粘稠的基因組DNA分離，離心后核蛋白存在于上清中，核蛋白的捕獲率高達90%。 3.對于膜蛋白，WB Super RIPA Lysis Buffer可大程度的破壞細胞膜和變性蛋白，使蛋白與膜分離，防止蛋白與膜復合物在離心后沉淀，從而防止蛋白丟失。 4.在提取蛋白過程中，基因組DNA釋放使得蛋白提取液變的十分粘稠，使用Benzonase核酸酶消化可有效解決。
儲存
置于室溫陰涼處，可保存2年。
實例
Fig.用WB Super RIPA Lysis Buffer和Co-IP/IP RIPA Lysis Buffer分別提取核蛋白PPARγ和膜蛋白PLD-1，上樣量分別為40ug和10ug總蛋白，ECL發(fā)光液顯色。A/C泳道為WB Super RIPA Lysis Buffer，B/D泳道為Co-IP/IP RIPA Lysis Buffer。由此圖比較分析表明WB Super RIPA Lysis Buffer能更充分的釋放核蛋白和膜蛋白，從而獲得更強的信號。

PCR 反應需要使用哪些試劑和設備？

試劑:
模板DNA：PCR反應需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；引物：PCR反應的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用，調節(jié)反應pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應特異性，從而提高反應效率；酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產物；
設備：
PCR儀：用于控制反應溫度，保證PCR反應時不同溫度環(huán)節(jié)的嚴格控制；電泳槽：用于分離PCR擴增產物；核酸提取儀：從組織樣本中全自動提取核酸。  這些試劑和設備在PCR分子生物學技術中均是，只有在有序齊全的基礎上，才能進行PCR反應并得出準確結果。

PCR相關基礎實驗：

PCR反應基本步驟一般的聚合酶鏈式反應由20到35個循環(huán)組成，每個循環(huán)包括以下3個步驟：

一、變性：

利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環(huán)之前，通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘，接下來PCR儀就控制溫度進入循環(huán)階段。

二、退火或稱接合,復性：

在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點5℃。錯誤的退火溫度可能導致引物不與模板結合或者錯誤地結合。該步驟時間1-2分鐘。

三、延伸：

DNA聚合酶由降溫時結合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統(tǒng)的Taq估計合成1000bp/min、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業(yè)公司生產的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

PCR反應條件優(yōu)化：

1、變性溫度和時間：

保證模板DNA解鏈是保證整個PCR擴增成功的關鍵。加熱90~95°C, 30~60s，再復雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續(xù)時間過長，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

2、復性溫度和時間:

PCR擴增特異性取決于復性過程中引物與模板的結合。復性溫度越高，產物特異性越高。復性溫度越低，產物特異性越低。需根據引物的Tm值具體設定。

3、延伸溫度和時間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個核苷酸時，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結合，可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應時間，可根據待擴增片段的長度而定，小于1kb, 1min足夠；大于1kb需加長延伸時間。Taq酶可根據1kb/min增加時間。這里需要注意，延伸時間過長可能出現(xiàn)非特異擴增。因此需要設置恰到好處的延伸時間。

4、循環(huán)數(shù):

其他參數(shù)選定后，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環(huán)后，PCR產物的積累即可達到最大值，實際操作中由于每步反應的產率不可能達到100%，因此不管模板濃度是多少，20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多，非特異擴增增加。

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