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Protein G aMagnetic Beads蛋白G磁珠公司正在出售的產(chǎn)品:人甲狀腺癌細(xì)胞 促腎上腺皮質(zhì)釋放激受體2封閉多肽 禽腺病毒PCR檢測試劑盒 大鼠抗雙鏈DNA抗體/天然DNA抗體(dsDNA) 試劑盒 ELISA 氨N去甲基化(AND)活性比色法檢測試劑盒 麥根腐平臍蠕孢 FAM50B蛋白抗體
更新時間:2024-01-12
商品屬性:
產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 貨號 |
Protein G Magnetic Beads蛋白G磁珠 | 1ml(50mg/ml) | A-Hc2057 |
Protein G Magnetic Beads 是大小均勻,具有分散度的,表面共價綴合超純(純度>97%)的重組蛋白 G 的二氧化硅基質(zhì)超順磁珠。這種磁珠是經(jīng)過專門設(shè)計(jì),并經(jīng)過嚴(yán)格質(zhì)量管理檢測的,主要用于當(dāng)使用的一級抗體確定時,用于免疫沉淀和細(xì)胞分選。 同時,也被廣泛用于從血清樣品,腹水,血漿或組織培養(yǎng)上清中快速和有效的一步純化多個種類的IgG 蛋白。表1總結(jié)了本磁珠的結(jié)合親和力和特異性。
產(chǎn)品特點(diǎn):
·適用于快捷,簡便的一步高通量程序;無需純化柱或過濾器,或者重復(fù)的移液或離心(Fig.1) ·由于磁珠的親水性表面,非特異性結(jié)合率極低
·結(jié)合容量
·對樣本體積要求低,便于自動化操作
·性價比高
產(chǎn)品屬性:
image.png
緩沖液成分:
·.Protein G Beads (懸浮在 10 mM Tris, 0.15 M NaCl, 0.1% BSA,1 mM EDTA, pH7.4, 0.1% NaN3 緩沖液中) ·1x Protein G Binding/Washing Buffer (57.7 mM Na2HPO4,42.3 mM NaH2PO4, pH 7.0) ·1x Protein G Elution Buffer (0.2 M Glycine/HCl,pH 2.5) ·1x Protein G Neutralization Buffer (1.0 M Tris-HCl, pH 9.0)
所需耗材:
磁力分離器(適用于手動操作):根據(jù)實(shí)驗(yàn)時生物樣品的體積,使用者可以選擇以下不同型號的磁力分離器:8 孔磁力架可以容納 8 個單獨(dú)的 1.5-2.0 ml離心管; 24 孔磁力架可以容納 24 個單獨(dú)的 1.5-2.0 ml 離心管; 4 孔磁力-15 可以容納4 個單獨(dú)的15ml 離心管; 4 孔磁力架-50 可以容納四個單獨(dú)的 50 ml 離心管。
操作過程: 此過程可被等比例放大或縮小
提示:
1. 該方案是經(jīng)過優(yōu)化的,可用于純化來自不同來源的大多數(shù)IgG抗體。然而, 由于沒有兩種抗體相同,因此不可能為所有IgG純化設(shè)計(jì)一個通用試劑 盒。為了獲得最佳結(jié)果,每個用戶必須根據(jù)故障排除部分中的建議,確定純 化單個抗體時的最佳工作條件,尤其是弱結(jié)合抗體(見表1)。
2. 為確保離子強(qiáng)度和pH值的最佳結(jié)合條件,有必要在純化前用Binding/ Washingbuffer按照至少1:1比例稀釋血清樣品、腹水或組織培養(yǎng)物。通 過離心或 0.2μ m過濾器過濾,去除樣品中的任何不溶性物質(zhì)。
3. 在純化IgG之前,用戶應(yīng)將試劑盒中包含的所有試劑平衡至室溫。
PCR基本步驟及注意事項(xiàng)?
一、實(shí)驗(yàn)原理
PCR是體外人工選擇性擴(kuò)增DNA的一種方法,它類似于生物體內(nèi)DNA的復(fù)制。在生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而體外PCR反應(yīng)同樣需要類似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設(shè)計(jì)的特定序列,實(shí)現(xiàn)對特定位置的擴(kuò)增;PCR Buffer提供一個反應(yīng)的緩沖環(huán)境;反應(yīng)過程同生物體內(nèi)一樣,DNA雙鏈打開,引物結(jié)合模板,延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈,而在體外在通過控制反應(yīng)溫度實(shí)現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈,在退火溫度處引物結(jié)合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反復(fù)重復(fù)此過程即可實(shí)現(xiàn)對特定片段DNA的大量擴(kuò)增。到第三循環(huán)開始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子,進(jìn)一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。
在擴(kuò)增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應(yīng)。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增,達(dá)到較高水平。因此,應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù),在平臺期前結(jié)束反應(yīng), 減少非特異性產(chǎn)物。到達(dá)平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。
二、主要的成分
1.模板可以是多種形式,主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物,cDNA等,但不能為RNA。對于不同類型的模板,其主要不同在于預(yù)變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預(yù)變性時間10min足夠,質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預(yù)變性2min、PCR產(chǎn)物預(yù)變性2min即可。
注意cDNA為單鏈DNA,但仍可做PCR的模板,只不過在第一輪循環(huán)時只有一個引物結(jié)合,合成另一條鏈。從第二輪開始,兩個引物均與特異位點(diǎn)結(jié)合,從而實(shí)現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進(jìn)行PCR擴(kuò)增,原因就在于實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)的是DNA聚合酶,只能特意識別DNA鏈。
2.對于模版的量來說,一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜,提取的濃度也往往比較大,為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響,故需對提取的DNA進(jìn)行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴(kuò)增。對于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡單,且提取濃度一般較低,則無需稀釋。
PCR實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該注意的問題有哪些?
沒有ct值
檢測結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問題:
1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準(zhǔn));
2、PCR程序設(shè)置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;
3、引物或探針降解。可通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;
4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據(jù)試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復(fù)凍融;
5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴(kuò)增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴(kuò)增)。
ct值過晚
在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準(zhǔn)確。
因此,判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和目的進(jìn)行。
1、擴(kuò)增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進(jìn)行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計(jì)不合理, 需要重新設(shè)計(jì);
2、PCR程序不合適, 改用三步法進(jìn)行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當(dāng)降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);
3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足;
4、PCR產(chǎn)物太長。PCR產(chǎn)物設(shè)計(jì)超過500bp;
5、模板中存在抑制物。用高純度模板進(jìn)行PCR檢測或?qū)⒛0暹M(jìn)行稀釋。
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